【摘要】僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕 Bombyx mori L. 4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌 Beauveria bassiana(Bals.) Vuill.而致死的干燥体。多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的蚕干燥。文章发表在《中外女性健康》上，是医学核心期刊发表范文，供同行参考。
【关键词】：僵蚕,抗凝活性部位,化学成分,凝胶色谱法,高效液相色谱法,氮测定法
僵蚕略呈圆柱形，多弯曲皱缩。长2～5cm，直径0.5～0.7cm。表面灰黄色，被有白色粉霜状的气生菌丝和分生孢子。头部较圆，足8 对，体节明显，尾部略呈二分歧状。质硬而脆，易折断，断面平坦，外层白色，中间有亮棕色或亮黑色的丝腺环 4 个。气微腥。味微咸。
1 实验材料
Waters 515 HPLC系统(Waters 公司);BS100A自动部分收集系统(上海市沪西仪器厂);Start-4半自动四通道血凝仪(法国STAGO公司);4300-Pro紫外分光光度计(瑞士安玛西亚公司);HR2838型匀浆机(菲力普公司);LP115 pH计(METTER TOLEDO公司);DDS-ⅡA电导率仪(上海理达仪器厂);移液枪(0.1 mL和1.0 mL,日本);半微量凯氏定氮装置;Z-16和Z-26层析柱(上海化学仪器厂)。
2 方法与结果
2.1 样品溶液的制备
称取制僵蚕1 500 g(样品A),用8倍量水浸泡过夜,以3 000 r/min匀浆,然后煎煮2次,每次30 min,过滤,合并滤液,离心,得提取液8 450 mL(样品B),将其浓缩至含原药材2 g/mL,加无水乙醇浓度至60%,4 ℃放置过夜,3 000 r/min离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约6 g/mL,即得粗提液240 mL(样品C)。
2.2 抗凝活性部位的化学成分理化鉴别
2.2.1 茚三酮反应、pH值、电导率、AgNO3/HNO3反应和CaCl2/HNO3反应 分别取B～E样品溶液进行理化测定,结果表明,僵蚕提取分离后的B～E样品所检测的理化性质结果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反应阳性,活性部分电导很大,与AgNO3产生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,与CaCl2产生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是盐类(如氯化物、草酸盐等)、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。
2.2.2 紫外吸收光谱
图2表明,样品B～E的UV光谱形状均不相同,表明提取分离所得样品化学成分有所不同。提取分离后除去了大量的无活性物质,特别是经过凝胶色谱纯化后,UV光谱变化较大。
2.2.3 样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析
取样品E中TT≥600 s的馏分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脱盐,4.0 mL/(10 min·管),自动分步收集器收集,测定各管的TT值、260 nm和280 nm处的吸光度及化学反应特性,结果见表1。表1 TT≥600 s馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检
2.3 定量分析
2.3.1 固形物含量测定
精密吸取样品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密称定,按每1 mL样品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和浓度(各样品均为n=3,RSD不超过0.8%),结果见表2。表2 僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果(略)注：*与样品A比
2.3.2 指标检测
蛋白质：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作,计算总氮含量。将该氮含量扣除铵态氮含量,再与6.25相乘,即为蛋白质质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n=3,RSD不超过1.4%。铵根[9]：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作(40% NaOH试液用120 g/L氧化镁悬浊液代替),计算铵根质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n=3,RSD不超过1.2%。草酸根[3]：精密取B～E样品液约5 mL,氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法测定(各样品均为n=3,RSD不超过1.0%)。结果见表3、表4。表3 僵蚕各部位中铵根和草酸根的测定结果(略)注：*与样品B比表4 僵蚕各部位固形物中蛋白质和草酸铵含量比较(略)
2.3.3 HPLC法测定氨基酸含量
2.3.3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm);流动相A为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流动相B为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脱;柱温：27 ℃;流速：1.0 mL/min;荧光检测器：λex 338 nm,λem 425 nm。
2.3.3.2 样品测定 样品溶液B～E经5.7 mol/L盐酸液,在110 ℃水解24 h,OPA试剂衍生化,然后取20 μL注入液相色谱仪。测定结果见表5。表5 僵蚕各部位中氨基酸的测定结果(略)
3 讨论
本研究表明,僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分。已有报道,草酸铵具有抗凝活性[8],本研究表明,凝胶色谱分离部位中不含草酸铵,但含多肽和氨基酸类成分的馏分具有抗凝活性,因此,僵蚕中的多肽类或氨基酸类成分可能是抗凝活性成分之一。本研究对僵蚕抗凝活性部位的化学成分和理化特性进行的初步探索,也为今后对僵蚕抗凝成分的分离纯化提供了实验基础。
中国医学核心期刊征稿：《中外女性健康》是由武汉大学主办，中外女性健康杂志社编辑出版的综合性医学学术期刊，本刊以各级医、护、检、药、管、教、研人员为主要读者对象，主要反映临床医学研究成果，突出报道医学新理论、新知识、新技术成果。
【参考文献】
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[2] 卫功庆,鞠贵春,李慧萍,等.白僵蚕化学成分的分析[J].吉林农业大学学报,1995,17(3)：46-49.
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