【摘要】目的：建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜(BBF)的模型，考察注射用双黄连对BBF形成的影响及抑制作用。方法：在特定的条件、方法下分别对细菌单独培养和细菌与提取物共同培养，通过酶标仪测量其OD值来考察BBF的生长能力。结果：注射用双黄连对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌BDF的形成均有抑制作用。文章发表在《健康之路》上，是医学论文发表范文，供同行参考。
【关键词】双黄连;细菌生物膜;影响
建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜(BBF)的模型，考察注射用双黄连对BBF形成的影响及抑制作用。
1 BBF模型的建立
1.1 大肠杆菌BBF模型的建立1.1.1 菌种的复活将大肠杆菌冻干粉加入0.4mlNB培养基溶解后，放入37℃恒温振荡器(230～240转/分钟)中培养8小时，分装在离心管中，加入0.5ml的50%甘油，置于液氮中，于-80℃冰箱中冷藏保存。
1.1.2 大肠杆菌BBF模型建立的方法将置于-80℃冰箱中的大肠杆菌划线于NB培养基的平板上，置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时。挑取平板上的单一菌落溶于5mlNB液体培养基中，于36℃恒温振荡器中振荡8小时，得到单克隆细菌增殖培养的菌液，备用。
将菌液稀释100倍置于96孔板中，四周为NB培养基作为空白。置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时，取出。将菌液倾出，用蒸馏水反复清洗后，加入0.1%结晶紫染色30分钟后，将结晶紫倾出，洗净，加入1%脱氧胆酸钠溶液，30分钟后，测其600nm处的OD值。以菌液浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，考察BBF生长情况。
1.2 影响大肠杆菌BBF生长的因素通过实验的反复摸索，我们发现影响大肠杆菌BBF生长的因素主要有以下几种：①菌种：不同的大肠杆菌菌株对BBF的影响很大，直接影响到BBF的生长与否和BBF形成的好坏。且大肠杆菌传代越多，BBF的生长情况越不好，故我们每次实验均采用大肠杆菌的第二代菌株。
②96孔板的材质：不同的细菌在不同材质的96孔板上的生长情况是不同的。我们选用了市场上常见的三种96孔板分别是进口聚氯乙烯(PVC)板，国产聚苯乙烯(PS)板，进口聚苯乙烯板，大肠杆菌分别在不同材质的96孔板上培养。结果，大肠杆菌在国产PS板上的生长情况是最好的。
③培养时间：考虑到实验操作时间的可行性，我们选定将大肠杆菌分别培养18小时、24小时、36小时，考察BBF的生长情况。结果，大肠杆菌在培养24小时后，BBF的生长情况最好。
1.3 金黄色葡萄球菌BBF的建立及影响因素金黄色葡萄球菌的BBF模型的建立方法基本上与大肠杆菌的相同。在这里就不做详细的介绍。我们仍旧分别考察了96孔板的材质、培养时间及菌液浓度等因素，最终确定金黄色葡萄球菌菌液稀释100倍、于国产PS板上培养24小时，BBF的生长的最好且稳定。
2 注射用双黄连对BBF的影响
2.1 培养方法的建立我们建立两种方法分别考察药物对BBF形成的影响及对BBF的抑制作用。96孔板的点样方法1：四周为菌液(NB培养基)。B行加入180μl菌液(NB培养基)，C～G行每孔各加入100μl菌液(NB培养基)，B行每孔用移液枪加入20μl药液，混匀，用多通道移液枪从B行吸出100μl移入C行，混匀，再从C行吸出100μl移入D行，依此类推至H行，吸出100μl后，弃去。即从B～H行药液浓度以2倍递减。96孔板的点样方法2：四周为菌液。B～G行加入100μlNB培养基，B行每孔用移液枪加入100μl药液，混匀，用多通道移液枪从B行吸出100μl移入C行，混匀，再从C行吸出100μl移入D行，依此类推至H行，吸出100μl后，弃去。即从B～H行药液浓度以2倍递减。
培养方法一：考察对BBF形成的影响。
按“96孔板点样方法1”完成后，依照“大肠杆菌BBF模型建立的方法”中置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时，以药液浓度为横座标，以平均OD值为纵坐标，作图，考察对BBF形成的影响。
培养方法二：考察对BBF的抑制作用我们先将96孔板全部点菌液，依照“大肠杆菌BBF模型建立的方法”置于恒温培养箱中，于36℃培养24小时，取出，此时BBF已经形成，将菌液倾出，按“96孔板点样方法”，将培养基培养24小时，以药液浓度为横座标，以平均OD值为纵坐标，考察对BBF的抑制作用。
2.2 考察对BBF形成的影响
图1注射用双黄连对大肠杆菌BBF形成的影响
将注射用双黄连加水溶解，配制成5mg/ml的药液，分别进行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养的操作。注射用双黄连对大肠杆菌BBF形成的影响结果见图1所示。
3 讨论
1)通过实验摸索，建立了可靠而稳定的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜(BBF)的模型，确定了影响因素。
2)96孔板清洗方法的摸索：96孔板的材质是BBF模型能够成功建立的重要因素，确定96孔板的清洗方法：先在96孔板内加注洗液，浸泡3～5分钟后，用手握持96孔板，甩干孔内液体;再用乙醇浸泡24小时后超声20分钟，自然晾干，即可。
3)考察了注射用双黄连对BBF形成的影响。得出注射用双黄连对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌BBF的形成均有明显的抑制作用。
4 结语
本实验建立了可靠而稳定的BBF模型，并通过此模型考察了中药注射用双黄连对BBF形成的影响，筛选出能够抑制或破坏BBF形成的活性成分，为从中药中开发治疗慢性感染性疾病的新药提供新的筛选模型，为科学、客观评价中医药在治疗慢性感染方面的作用提供了新的方法。
医学论文发表须知：《健康之路》杂志创刊于2002年，是经中华人民共和国新闻出版总署批准的、由广东省科学技术协会主管、中国保健协会与广东省医学会主办的面向国内外公开发行的健康科普类期刊，国际标准刊号：ISSN1671—8801，国内统一刊号：CN44—1540/R，广告经营许可证：粤440000400123。《健康之路》是我国健康保健领域极具影响力与权威性的健康生活类杂志，是中共广东省委保健办公室指定刊物，是全国各省市处级以上领导优先阅读的具有保健前瞻性的重要刊物。2004年，《健康之路》被中国期刊协会评为“全国深受读者喜爱的医疗科普杂志”。
