【摘要】 由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏，体外组织培养也一直没有太大进展，且不能在体外人工培养，制约了对HBV的研究[1]. 将HBV DNA转移至靶细胞，建立表达HBV的体外培养细胞模型对研究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义
【关键词】 肝炎病毒，乙型;基因组，病毒;克隆，分子;转染;细胞培养;基因表达
目的： 建立HBV体外细胞培养体系. 方法： 构建HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2细胞，G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg，HBeAg的表达，免疫组化检测细胞内HBcAg的表达，RTPCR检测细胞S基因mRNA的表达，PCR检测细胞上清液DNA. 结果： 成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2后，培养上清HBsAg，HBeAg阳性，细胞内HBcAg呈核浆型分布，且以浆型分布为主. RTPCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达，上清中HBV S及前S基因阳性，荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论： 重组质粒pcDNA33HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制，该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.
0引言
由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏，体外组织培养也一直没有太大进展，且不能在体外人工培养，制约了对HBV的研究[1]. 将HBV DNA转移至靶细胞，建立表达HBV的体外培养细胞模型对研究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义[2-4]. HBV基因组呈双链闭合环状，基因结构紧凑，其开放读框分布于全长DNA，为使完整的转染基因能在细胞内复制，目的基因的长度要大于一个HBV DNA单元[5-6]. 我们构建3倍HBV基因的重组真核表达质粒，转染细胞，以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型，并研究其产生HBV的水平.
1材料和方法
1.1材料HBV全基因亚克隆载体pUC193HBV为pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位点中插入头尾相连的HBV(adr亚型)三连体，由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠，保存在大肠杆菌DH5α中. 真核细胞表达载体pcDNA3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠;人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)由第四军医大学微生物学教研室惠赠，本室传代培养;内切酶EcoRⅠ, HindⅢ, T4 DNA连接酶,Taq DNA聚合酶,反转录酶及DNA marker(TakaRa公司);质粒提取试剂盒(西安市莱博科技发展有限公司);LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司);DMEM培养基，G418(Gibco公司);新生小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司);ELISA检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司);SABC免疫组化试剂盒，DAB染色剂(武汉博士德生物工程有限公司);S基因，βactin 及HBV 前S/S基因引物均由北京赛百胜公司合成.
1.2方法
1.2.1pUC193HBV和pcDNA3的酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培养 pUC193HBV和pcDNA3，以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HBV和pcDNA3，分别以EcoRⅠ, HindⅢ单酶切pUC193HBV，以EcoRⅠ, HindⅢ双酶切pUC193HBV和pcDNA3，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，利用胶回收试剂盒回收9600 bp HBV全长基因片段和线性pcDNA3.
1.2.2pcDNA33HBV重组质粒的构建及鉴定HBV DNA与 线性pcDNA3以浓度比3∶1混合，在T4 DNA连接酶作用下4℃连接16 h. 连接产物转化感受态细胞DH5α. 随机调取抗性菌落，经小量扩增，提取质粒，分别以EcoRⅠ, HindⅢ单酶切并以二者双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定.
2结果
2.1pUC193HBV, pcDNA3和pcDNA33HBV的酶切鉴定pUC193HBV双酶切后，电泳出现两条带，片段大小约2900 bp(pUC19)和9600 bp(3HBV)，单酶切条带均在9416 bp与23130 bp之间，pcDNA3双酶切为5400 bp的片段. 连接产物双酶切后，电泳出现两条带，分别为5400 bp(pcDNA3)和9600 bp(3HBV)，单酶切条带均在9416 bp 与23 130 bp之间，与预期结果相符(图1) ，且测序证实连接正确.
1,6: pcDNA3经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切; 2: pUC193HBV经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切; 3: pUC193HBV经EcoRⅠ酶切; 4: pUC193HBV经HindⅢ酶切; 5, 10: DNA marker λHindⅢ digest; 7: pcDNA33HBV经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切;
8: pcDNA33HBV经EcoRⅠ酶切; 9: pcDNA33HBV经HindⅢ酶切.
2.2抗G418细胞克隆的形成及筛选转染后4 wk内对照组HepG2细胞在G418的作用下全部死亡，同时转染pcDNA33HBV组HepG2细胞阳性克隆形成. 挑取阳性克隆继续用G418筛选培养，建立了携带HBV全基因的细胞系.
2.3ELISA法检测HBsAg和HBeAg表达转染pcDNA33HBV细胞组上清中HBsAg, HBeAg均阳性，而对照组HepG2细胞上清始终为阴性.
3讨论
随着分子生物学的发展,将重组基因转入动物细胞并表达已成为确定和分析功能基因产物的有力手段，大大促进了HBV的研究. 有研究报道，迄今用于繁殖HBV的所有组织培养系统，都是用串联的HBV基因组，常在很强的外源性启动子的控制下，这些系统可用于生成大量病毒[1]. 我们构建的pcDNA3 3HBV，含完整的头尾串联的HBV全基因，载体pcDNA3带有CMV早期启动增强子，转染细胞后，能有效合成和分泌HBsAg， HBeAg. RTPCR显示转染细胞有HBV特异性S基因mRNA的表达，证实该转染细胞中存在HBV转录、复制过程. 且转染细胞上清中扩增出前S/S基因，即整个S区，说明有病毒DNA的存在. 其中前S1蛋白位于完整的病毒颗粒(Dane颗粒)表面，与病毒的装配和感染密切相关[7]，具有与肝细胞受体结合的位点[1]. 由此说明转染细胞可分泌结构较完整的病毒颗粒. 荧光定量PCR进一步证明该细胞系能产生较高滴度的HBV DNA.
