摘 要： 本研究采用PCR技术对采自广州附近海域的斑点马鲛，19个个体的线粒体DNAD-loop基因进行扩增和分析，结果表明，该斑点马鲛群体的遗传多样性较为丰富，19个个体通过聚类形成2大分支，表明该群体可能来源于2个不同的母系祖先。
关键词：遗传多样性; 斑点马鲛; 线粒体DNA
斑点马鲛属鲭科马鲛属，是暖水性鱼类，是我国南海区重要的经济鱼类。目前尚无关于斑点马鲛群体遗传多样性的研究报道。线粒体DNA控制区是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域，被广泛应用于鱼类种群遗传学研究。本研究利用相应的引物对分布于南海的斑点马鲛的控制区部分序列进行了PCR 扩增和序列测定，分析该斑点马鲛群体的遗传多样性，以期为制定合理的斑点马鲛资源增殖和保护措施提供科学依据。
1 材料和方法
1.1实验材料 斑点马鲛样品于2007年6月取自广州，冷冻或新鲜样品运回实验室，取背部肌肉保存于95.0%酒精中。
1.2 实验方法 按传统法(酚/氯仿抽提法)从肌肉中提取基因组DNA，将提取DNA溶解于超纯水中，置4ºC保存。用于扩增控制区的扩增引物为：DL-：5’-CTGGAAAGAACGCCCGGCATG-3’。PCR反应体积为25 µL，其中包括50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 200 µmol/L，Ex Taq酶1.25 units，引物0.2 mmol/L，模板DNA 1µL，加灭菌蒸馏水至25 µL。PCR反应在Eppendorf Mastercycler 5333扩增仪上进行。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，然后进行40个循环，每个循环包括94℃45s，50℃45s，72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。以上反应均用阴性对照来检查是否有DNA污染。取1.5 µL扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。用小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)进行PCR产物回收和纯化，回收产物由上海桑尼生物科技有限公司经ABI公司3730 型全自动序列分析仪进行测序。
1.3 数据分析 用DNASTAR软件进行排序，并结合人工校正。通过MEGA(molecular evolutionary genetics analysis, Kumar 等，1993)软件统计所测序列的碱基组成，并计算出不同个体间的遗传距离，并构建NJ系统树。用DNASP(DNA Sequences Polymorphism)软件进行单倍型多样度(HD)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异数(K)等遗传多样性参数的计算。
2 结果
2.1 目的片段的PCR扩增及序列测定 本实验共测定了斑点马鲛的19个个体的mtDNA D-loop基因片段，其碱基序列为514bp，A、T、C、G 4种碱基在19个个体中的平均含量分别为35.5%(35.2%-35.8%)、30.6%(30.1%-30.9%)、19.4%(19.1%-19.7%)、14.5%(14.2%-15.0%)，AT含量(66.1%)高于GC含量(33.9%),其碱基的平均含量与蓝点马鲛比较相似。斑点马鲛mtDNA-loop基因的AT含量(66.1%)与蓝点马鲛(68.2%)、太平洋鲭鱼D-loop基因的AT含量(63.8%)非常接近，这也符合脊椎动物mtDNA D-loop区域碱基组成的特点。
2.2 变异位点的分布 31个变异位点在19条斑点马鲛D-1oop序列中的分布如表1所示，其中简约信息位点为8个，它们分别位于第18、24、80、196、217、277、384、442位，其余的23个为单态信息位点。从表中还可以看出，19个个体的序列除2号和8号鱼序列相同外，其他个体都不完全相同，即19个个体共有18种单倍型，单倍型多样度为0.994，核苷酸多样度为0.00798。514 bp长度的核苷酸序列中共存在3个碱基插入(24、180、494)，20个转换位点(A-G、C-T)，5个颠换位点(位点8、34、282、488、491)及3个转换与颠换同时存在的位点(位点197、198、483)。
2.3 斑点马鲛不同个体间的遗传距离 应用MEGA2软件，根据D-loop序列算出了19个个体间的Kimura遗传距离，19个个体中，除了SG2和SG8之间的遗传距离为0.0000，其他任何2个个体间的遗传距离均不为0.000，故共有18种单倍型;19个个体中SG.12与SG.14的遗传距离遗传距离最大为0.0179;19个个体间的碱基差异数在0～9之间。
表1 变异位点在19条斑点马鲛D-loop序列中的分布
2.3 NJ系统树的构建 以19个个体的控制区序列构建的NJ系统树分别如图1所示。从图中可以看出，2种方法得到的系统树的拓扑结构相似，19个个体形成了2大分支。线粒体DNA属于母系遗传，可推断该群体的19个个体可能来源于2个不同的母系祖先。
图1 由控制区序列得到的NJ系统树
3 讨论
在19个蓝点马鲛个体中检测到18个单倍型，单倍型多样度为0.994，核苷酸多样度为0.00798。本研究从控制区序列获得的群体遗传多样性参数和个体间的遗传距离都表明了，斑点马鲛南海水域群体目前的遗传多样性非常丰富。这种现象一方面与种类差异有关;另一方面，可能与斑点马鲛的栖息地多样性、活动范围大有关。因为斑点马鲛有广泛分布于南海水域的产卵场、索饵场和越冬场，并作长距离洄游。此外，斑点马鲛不同于梭鱼等其它增养殖鱼类，尚未受到由于种苗培养而导致的近交等方面的影响，因而具有较丰富的遗传多样性。从遗传学角度讲，一个物种的遗传多样性高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关。物种的遗传多样性越丰富，其进化的潜力就越大，或者说遗传多样性为物种的进化提供了潜在的原料储备。而遗传多样性的降低可导致其适应能力降低、物种退化甚至威胁物种生存。近年来由于盲目发展流网数量，网目缩小以及秋后大量拖捕当年幼鱼，致使鱼体小型化、渔获组成低龄化，严重损害幼鱼资源，造成产量不稳。长久下去，将会损害其遗传多样性和种质资源的稳定性。因此，应采取有效措施，以维持现有的遗传多样性为前提，合理保护斑点马鲛种质资源，以求其资源的可持续利用。
